生化|常用分子生物学技术的原理及其应用细节总结

1.DNA印迹(Southern blotting)需要使用核酸内切酶但RNA印迹(Northern blotting)由于RNA分子较小,生化无需进行限制性内切酶切割

2.RNA印迹(Northern blotting)监测RNA虽然敏感性低于PCR技术,常用但是分生其特异性强,假阳性率低,物学为最可靠的技术节总结mRNA和非编码RNA的定量分析方法之一

3.在蛋白质印迹(Western blotting)中蛋白质的转移只有靠电转移才能实现,其分析主要靠抗体(特异性抗体作为第一抗体,理及碱性磷酸酶,用细辣根过氧化物酶标记或放射性同位素标记的生化物质作为第二抗体)实现,骨又称为免疫印迹

4.除以上三种印迹方法外,常用还有斑点印迹(无需电泳,分生直接转移到NC膜上),物学原位杂交(利用组织切片或细胞涂片),技术节总结DNA芯片技术(用于检测细胞或样品中的理及核酸种类)

5.聚合酶链反应(PCR)的特异性依赖于与模板DNA两端互补的寡核苷酸引物

6.组成PCR反应体系的基本成分有模板DNA,特异引物,用细耐热性DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶),生化dNTP以及含有Mg2+的缓冲液

7.PCR的基本反应步骤:变性(约95℃),退火(约55℃),延伸(约72℃)

8.PCR的主要用途:获得目的基因片段,DNA和RNA的微量分析,DNA序列分析,基因突变分析,基因的体外突变

9.逆转录PCR技术(RT-PCR)是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知RNA序列进行变性和半定量分析的最有效方法,也是最广泛使用的PCR方法

10.原位PCR技术可以将目的基因的扩增与定位相结合

11.实时PCR=定量PCR(qPCR)=实时荧光定量PCR=荧光定量PCR

12.非引物探针类实时PCR常采用SYBR Green(结合与DNA双螺旋小沟区域)作为荧光染料

13.常用引物探针类实时PCR有TaqMan探针法,分子信标探针法,荧光共振能量转移探针法

14.实时PCR的应用领域:肿瘤,多态性,病原体检测;DNA测序的应用领域:确定单基因遗传病和多基因变异相关疾病的SNP位点,肿瘤,个人基因组分析,病原微生物检测

15.Sanger双脱氧测序法也称为链终止法(需采用可分辨1个核苷酸差别的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳)

16.ddNTP:2’,3’-双脱氧核苷三磷酸

17.早期的全自动DNA序列分析仪的工作原理主要是基于Sanger法

18.一些NGS(新一代测序)技术需要首先进行待测DNA片段的PCR扩增,而第三代测序技术则无需进行PCR扩增反应(Heliscope测序技术,单分子实时技术,基于荧光共振能量转移的测序技术)

19.基因芯片又被称为DNA微阵列,原理是双色荧光探针杂交

20.通过沉淀将蛋白质浓缩分离的三种主要方式:有机溶剂,盐析,免疫沉淀

21.血浆中的清蛋白和球蛋白前者可溶于pH=7.0的半饱和硫酸铵溶液中,后者则发生沉淀,在硫酸铵溶液达到饱和时,清蛋白也随之析出

22.进行免疫沉淀时,常将抗体交联至固相化的琼脂糖珠上,获得抗原抗体复合物后溶于十二烷基硫酸钠(SDS)和二巯基丙醇的缓冲液后加热,使得抗原从复合物分离而纯化

23.透析和超滤法可以去除蛋白质分子中的小分子化合物,后者主要利用正压或离心力

24.电泳可分为纤维薄膜电泳和凝胶电泳等十二烷基硫酸钠(SDS带负电荷,可使得SDS蛋白质在SDS-PAGE中的泳动速率只与蛋白质颗粒大小有关)

25.等点聚焦电泳(IEE)可使蛋白质泳动至与其自身pI值相等的pH区域

26.双向凝胶电泳(2-DE)第一向是IEE,第二向是SDS-PAGE

27.离子交换层析使用的阴离子交换树脂颗粒带正电荷

28.凝胶过滤又被称为分子筛层析

29.超速离心时沉降停止的条件为检测物所受的浮力与离心所产生的力相等

30.测定多肽链氨基端的氨基酸残基时可利用二硝基氟苯或丹酰氯,测定羧基端时可采用羧肽酶

31.采用离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分

32.测定肽链序列时可采用胰蛋白酶法(水解精氨酸或赖氨酸羧基侧的肽键),胰凝乳蛋白酶法(水解芳香族氨基酸的羧基侧肽键),溴化氰法(水解甲硫氨酸羧基侧的肽键)

33.水解蛋白质后产生的各肽段的氨基酸排列顺序一般采用Edman降解法(利用异硫氰酸苯酯)

34.圆二色光谱法(CD)可测定溶液状态下的蛋白质二级结构,α螺旋的CD峰一般由3个成分,而β折叠的CD谱不很固定

35.X射线衍射测量蛋白质三维结构时需要先将蛋白质制备成晶体,核磁共振技术主要测定蛋白质的液相三维结构

36.蛋白质相互作用研究技术有标签蛋白沉淀,酵母双杂交技术等

37.标签蛋白沉淀技术目前最常用的标签的谷胱甘肽-S-转移酶(GST),利用GST与GSH的结合作用,采用共价偶联了GSH的琼脂糖珠进行标签蛋白沉淀实验;另一个常用的标签分子是可以与镍离子琼脂糖珠结合的6个连续排列组氨酸标签(6×His)

38.酵母双杂交技术依赖的转录激活因子GAL4有BD(DNA结合区)和AD(促进转录的活性区)两个区域,作用:证明两种蛋白质具有相互作用;分析已知存在相互作用的两种蛋白质的相互作用功能结构域或关键氨基酸残基;获得未知的相互作用蛋白质

39.染色质免疫沉淀技术(ChIP)可以与芯片技术结合在一起,建立起ChIP-chip技术,可在全基因组筛选与特定蛋白质相结合的DNA序列

40.在分子杂交实验中,特定的DNA探针可以与序列互补或基本互补的DNA或RNA单链结合

41.RT-PCR先进行逆转录(以RNA为模板)再进行PCR反应(以cDNA为模板)

42.cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所代表的全部mRNA,经逆转录而合成的cDNA序列的克隆受体

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